FREQUENZA DELLA SEKVENCA | Radio Študent

FREQUENZA DELLA SEKVENCA

Oddaja

Dobrodošli v oddaji Frequenza della Scienza na valovih Radia Študent, v kateri bomo tokrat govorili o našem dednem materialu. DNK, geni, genom, dedni material, ... Gre za pojme, ki jih v vsakdanjem življenju pogosto slišimo, običajno v kontekstu gensko spremenjenih organizmov, dednih bolezni in znanstvenih odkritij, vendar si marsikdo ne predstavlja, kaj DNK in geni sploh so. V današnji oddaji se bomo tako posvetili glavnim odkritjem v bogati zgodovini DNK molekule od napredka v tehnologiji določanja zaporedij DNK do tega, kaj nam ta zaporedja razkrivajo in česa o njih še danes ne razumemo.

Za začetek bomo razložili osnovne pojme, okrog katerih bo nocoj tekla beseda. Deoksiribonukleinska kislina ali na kratko DNK je verižna molekula, ki se nahaja v jedru evkariontskih celic in nukleoidu prokariontskih celic ter nosi naš dedni zapis. Sestavljena je iz dveh zelo dolgih verig, ki se ovijata ena okrog druge. Zato pravimo, da ima DNK obliko dvojne vijačnice. Vsaka od verig je sestavljena iz štirih osnovnih gradnikov, imenovanih nukleotidi. Gre za relativno majhne organske molekule, ki so sestavljene iz treh komponent - anorganske fosfatne skupine, sladkorja riboze ter organske dušikove baze. Poenostavljeno nukleotide poimenujemo kar po organskih dušikovih bazah, in sicer adenin, timin, citozin in gvanin, na kratko A, T, C in G.  Molekula DNK se tako zdi kot zelo dolga beseda, sestavljena iz štirih različnih črk.

Sedaj ko vemo, kaj je DNK, lahko prisluhnemo profesorju Radovanu Komelu z Inštituta za biokemijo Medicinske fakultete v Ljubljani, ki nam je razložil, kaj je gen.

izjava...

Zaporedje DNK se torej v celičnem jedru sprva prepiše v molekulo RNK, ki je po zgradbi sorodna DNK. RNK nato potuje v citoplazmo, kjer poteče prevajanje zaporedja RNK v zaporedje aminokislin, ki tvorijo protein. Proteini pa so tiste molekule, ki opravljajo večino funkcij v celici in določajo, kako bo izgledala ter kako se bo obnašala. Odgovorni so denimo za metabolne procese, krčenje mišic in rast las.

Danes nam je vse to znanje samoumevno, o omenjenih procesih se učimo že v šoli. Vendar so se znanstveniki in znanstvenice še ne tako dolgo nazaj pošteno praskali po glavah, da bi doumeli naravo življenja na molekularnem nivoju.

Premaknimo se torej v obdobje, ko smo o procesih v celicah vedeli še nekoliko manj. V drugi polovici devetnajstega stoletja so raziskovalci že poznali osnovne zakone dedovanja in so vedeli za obstoj kromosomov, ki so zgoščena oblika molekule DNK, vidna v določeni fazi celične delitve. Kar je manjkalo, je ključni podatek, in sicer katera snov prenaša informacije iz roda v rod.

Leta 1869 je Friedrich Miescher, biokemik švicarskega rodu, iz gnojnih povojev bolnikov iz lokalne bolnišnice izoliral takrat še nepoznano snov. Ugotovil je, da je prisotna le v kromosomih in jo poimenoval nuklein. Zaradi pomanjkanja metod je nato trajalo še desetletja, preden so znanstveniki uspeli razvozlati kemijsko naravo nukleina. Šele v tridesetih letih dvajsetega stoletja so ugotovili, da je nuklein, ki so ga kasneje preimenovali v DNK, zgrajen iz že prej omenjenih gradnikov adenina, timina, citozina in gvanina.

Do spoznanja, da je molekula DNK nosilka dedne informacije, je prišlo leta 1944 v raziskovalni skupini Oswalda Theodora Averyja. Njihovo delo je temeljilo na predhodnih ugotovitvah Fredericka Griffitha, ki je preučeval bakterijo Pneumococcus, povzročiteljico pljučnice. Znano je bilo, da obstajata dva seva te bakterije, sev G in sev H, prvi škodljiv in drugi neškodljiv.

Ko je Frederick Griffith v miško vbrizgal pnevmokoke seva G, je ta v nekaj dneh poginila, če pa je vanjo vbrizgal sev H, je ostala zdrava. Pri nadaljnjih poskusih pa so stvari postale zanimive. Opazil je, da v primeru, ko v miško vbrizga mrtve bakterije škodljivega seva G in žive bakterije neškodljivega seva H, miška prav tako zboli in pogine. Iz tega je sledilo, da mora obstajati neka komponenta, ki jo sev H lahko prevzame od seva G in tako tudi sam postane patogen.

Na osnovi Griffithovih študij so v štiridesetih letih naprej gradili Avery in njegova skupina. Zanimalo jih je, katera sestavina celic je odgovorna za genetsko spremembo. Izvedli so serijo poskusov, v katerih so sistematično razgrajevali komponente celic in opazovali, ali še vedno pride do prenosa lastnosti z enega seva na drugega. Šele ko so mrtvim celicam škodljivega seva G dodali encim, ki razgrajuje molekule DNK, je sev H še naprej ostal neškodljiv. To je pomenilo, da je molekula DNK tista, preko katere se prenašajo informacije o lastnostih živega.

Odkritje je bilo pravo presenečenje, saj si raziskovalci takrat niso znali predstavljati, kako bi molekula s tako preprosto zgradbo, kot jo ima DNK, sploh lahko nosila toliko informacij. Mnogi biokemiki so bili mnenja, da so verjetnejši kandidat za prenos dednine proteini, ki so sestavljeni iz mnogo več gradnikov kot DNK. Situacija je podobna, kot če bi primerjali, ali lahko zapišemo več različnih besed z abecedo iz štirih ali iz dvajsetih črk.

V naslednjih nekaj letih pa je vendarle postalo neizpodbitno, da je molekula DNK tista, ki nosi dedni zapis. Sledi kratek glasbeni premor, po katerem bomo predstavili naslednje veliko odkritje, in sicer odkritje zgradbe molekule DNK.

vmesni komad

Vračamo se v oddajo Frequenza della Scienza na frekvenci 89,3 MHz. V današnji oddaji se posvečamo zgodovini odkritij in tehnologiji, ki sta povezani z molekulo DNK. Povedali smo že, kako je prišlo do odkritja, da je DNK naš dedni material, sedaj pa nadaljujemo s tem, kako so znanstveniki in znanstvenice razvozlali strukturo dvojne vijačnice.

James Watson, po osnovni izobrazbi biolog, se je z molekulo DNK ukvarjal že v času svojega doktorata. Kasneje je dobil mesto raziskovalca v Cavendishevem laboratoriju na univerzi v Cambridgeu. Tam je spoznal fizika Francisa Cricka, s katerim sta kasneje razvozlala strukturo vijačnice DNK.

Takrat so raziskovalci in raziskovalke že domnevali, da ima DNK vijačno strukturo. Watson in Crick sta si pri sestavljanju modela pomagala s podatki, ki jih je z rentgensko kristalografijo pridobila vneta znanstvenica Rosalind Franklin. Gre za metodo, pri kateri vzorce molekul obsevamo z rentgenskimi žarki in na podlagi uklona žarkov dobimo informacije o strukturi molekul. Watson in Crick sta sprva sestavila model, pri katerem naj bi bila DNK sestavljena iz treh verig, nukleotidi pa naj bi štrleli navzven. Ko se je ta izkazal za napačnega, sta odkrivanje strukture za nekaj časa opustila.

V vmesnem času je tudi priznani kemik Linus Pauling oznanil, da je odkril strukturo vijačnice, a se je prav tako motil. Ko pa sta biolog in fizik nekoliko poglobila svoje znanje o strukturi samih nukleotidov, se jima je posvetilo, da je struktura dvojna vijačnica, ki jo povezujejo vodikove vezi med nukleotidi. DNK torej izgleda kot nekakšna zavita lestev.

Po odkritju strukture so sledile raziskave, s pomočjo katerih so ugotovili, kako poteka podvojevanje DNK pred celično delitvijo in tudi kako poteka prevajanje nukleotidnega zaporedja v zaporedje aminokislin, ki tvorijo proteine. Raziskave so pokazale, da podvojevanje DNK poteče tako, da se dvojna vijačnica razpre, nato pa encimi polimeraze DNK ob vsaki izmed dveh verig sintetizirajo eno novo verigo. Tako iz ene dvojne vijačnice nastaneta dve dvojni vijačnici.

Z novo pridobljenim temeljnim znanjem so se tedaj znanstveniki lahko lotili vprašanj, usmerjenih v raziskovanje denimo dednih bolezni. V ta namen so potrebovali orodje za prebiranje zaporedja nukleotidov molekule DNK oziroma sekvenciranje, torej kako so v molekuli nanizani nukleotidi A, C, G in T. Na začetku je bil to zelo dolgotrajen proces, zaporedja, ki so jih lahko določili, pa so bila zelo kratka. Sčasoma pa so metode napredovale, postale zmogljivejše in omogočale določanje zaporedja vedno daljših sekvenc. O razlikah med starimi in novimi metodami nam je povedal doktor Denis Kutnjak z Nacionalnega inštituta za biologijo.

izjava...

Razvoj metod na področju sekvenciranja je bil tesno povezan s projektom Človeški genom, ki je potekal med letoma 1990 in 2003. Ko se je sekvenciranje DNK začelo, so raziskovalci in raziskovalke mislili, da bodo z določitvijo zaporedja človeškega genoma lahko naredili velik napredek na področju medicine. Kako je v koncu osemdesetih letih prejšnjega stoletja nastal in potekal projekt Človeški genom, nam je povedal profesor Radovan Komel z Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani.

izjava..

Vendar pa je že kmalu po začetku projekta prišlo do spora med vodilnimi znanstveniki. Eden izmed znanstvenikov, vključenih v projekt, Craig Venter, je namreč izumil metodo, s katero je želel odkriti in patentirati gene. Tako se je od projekta odcepil in ustanovil podjetje Celera Genomics, katerega cilj je bil prav tako določiti zaporedje človeškega genoma. Nadaljuje profesor Komel:

izjava..

Osnutek zaporedja človeškega genoma so sestavili leta 2000, in sicer je Konzorcij Človeški genom za le nekaj dni prehitel zasebno podjetje Celera Genomics. Kljub temu da je od prve objave torej minilo že 16 let, pa še vedno ne poznamo vzrokov za vse bolezni in rešitev zanje, kot so napovedovali, preden so zaporedje genoma določili. Zgolj poznavanje nukleotidnega zaporedja namreč ne zadošča, saj je nastanek večine bolezni odvisen od več različnih genov, njihovega izražanja in tudi okoljskih vplivov. Pravi pomen projekta se tako skriva predvsem v napredku na področju tehnologije, in sicer nam veliko pove podatek, da je od začetka projekta Človeški genom, ki je bil vreden kar tri milijarde dolarjev, cena sekvenciranja padla na približno tisoč dolarjev. Sledi še en glasbeni premor, po katerem bomo prešli na bolj aplikativni del današnje oddaje, in sicer se bomo posvetili različnim področjem, kjer se določanje zaporedij uporablja.

vmesni komad

Vračamo se v oddajo Frequenza della Scienza na temo molekule DNK in določanja njenega zaporedja. Od zgodovine se premikamo v sedanjost. Seznanili se bomo z možnostmi uporabe sekvenciranja nukleotidnih zaporedij v različnih vejah znanosti.

Uporaba metod sekvenciranja je široka, raznolika in se širi na nova področja. Tam počasi zamenjuje ter nadgrajuje starejše in okornejše metode za analizo DNK. Danes se sekvenciranje uporablja kot nekakšen molekularni mikroskop. Ta predstavlja nepogrešljivo orodje v molekularni biologiji, ki je razširjeno tudi na področja evolucijske biologije, metagenomike, medicine ter forenzike. Ob uporabi novih metod sekvenciranja je vedno prisotno tudi zavedanje prihodnosti in potenciala, ki ga ima za raziskovanje še nerazrešenih bioloških problemov.

V molekularni biologiji se sekvenciranje uporablja za določanje zaporedij kratkih molekul DNK, posameznih genov, genetskih regij, kromosomov in celotnih genomov organizmov. Predstavlja tudi najbolj učinkovito pot za določitev zaporedja molekul RNK. Informacija, ki jo s tem pridobimo, omogoča odkrivanje sprememb, mutacij v genih ter nam pomaga razumeti povezave med geni in lastnostmi posameznega organizma.

Iz osnovnih principov uporabe sekvenciranja pa so se razvila številna orodja, namenjena za bolj specifične naloge. Z njimi lahko opazujemo, kdaj so nekateri geni prižgani in drugi ugasnjeni. Prav tako lahko preučujemo strukturo molekule RNK, ki omogoča izražanje genov do proteinov, ali določimo mesta na molekuli DNK, kamor se vežejo proteini, ki vplivajo na izražanje genov. O spremembah, ki jih napredek metod sekvenciranja prinaša v delo raziskovalcev in raziskovalk, smo povprašali Denisa Kutnjaka z Nacionalnega inštituta za biologijo.

izjava..

Eden najpomembnejših načinov uporabe tehnologije sekvenciranja naslednje generacije je določitev celotnega genoma posamezne vrste. Tako kot ljudje prebiramo črke v knjigah, naprave za sekvenciranje prebirajo DNK zaporedja genomov. Najprej so se raziskovalke in raziskovalci lotili genomov modelnih organizmov, kot so bakterija E. coli, vinska mušica, kvasovke ter, kot smo že omenjali, genoma človeka. Nadaljujejo pa se tudi projekti določanja genomov najrazličnejših organizmov, kar je močno povezano z nižanjem cene sekvenciranja, krajšanjem potrebnega časa in avtomatizacijo metod.

Zaporedja genomov, ki jih pridobimo s sekvenciranjem, omogočajo nov vpogled v taksonomijo, sorodstvene odnose med vrstami in razumevanje evolucije. Primer doprinosa sekvenciranja k raziskovanju evolucije je endosimbiontska hipoteza, ki opisuje nastanek celičnih organelov večjih evkariontskih celic z vključitvijo manjših bakterij. Celični organeli, kot so mitohondriji in plastidi, so po velikosti ter enostavni delitvi namreč podobni bakterijam. Najpomembnejše pa je, da vsebujejo svojo lastno nukleinsko kislino. Endosimbiontska hipoteza je bila prvič omenjena že leta 1905, šele s sekvenciranjem pa smo jo lahko dokončno potrdili. Za širše razumevanje nastanka evkariontske celice lahko poslušate oddajo In bila je celica.

Eden od razlogov, zakaj sekvenciramo genome različnih vrst, pa so metagenomske analize, ki brez baz podatkov o sekvencah genomov ne bi bile mogoče. Več o metagenomskem pristopu nam je povedal Denis Kutnjak.

izjava...

Metagenomika predstavlja vpogled v združbe organizmov. Gre za sekvenciranje vsega genetskega materiala, prisotnega v določenem vzorcu. Prednost metagenomskega pristopa je v tem, da preučevanih mikroorganizmov ni treba gojiti in jih v večini primerov tudi ne znamo.

Rezultati prvih metagenomskih študij so najbolj presenetili s tem, da smo v okoljskih vzorcih dokazali do desetkrat več različnih organizmov, kot je navajala starejša literatura. S sekvenciranjem tako spoznavamo kompleksnost in raznolikost ekosistemov.

Metagenomske študije se uporabljajo za raziskave okoljskih vzorcev, kot so tla, voda, sedimenti. Veliko presenečenj ponujajo raziskave človeškega mikrobioma. Gre za združbo vseh mikroorganizmov - bakterij, virusov, praživali in gliv, ki poseljujejo naše telo. Človek naj bi vseboval desetkrat več bakterij kot lastnih celic ter tisočkrat več bakterijskih genov. Mikrobiom prebavnega trakta številne študije povezujejo s pojavljanjem bolezni, kot so debelost, sladkorna bolezen ter avtoimunske bolezni, zaradi česar je poznavanje teh bakterij izredno pomembno.

Enostavna in učinkovita uporaba metagenomskega pristopa je v diagnostiki bakterijskih in virusnih okužb. Sekvenciranje  DNK v zdravem in bolnem tkivu bo pokazalo, katera DNK je odveč in najverjetneje pripada povzročitelju bolezni. Več o uporabi metod naslednje generacije sekvenciranja v diagnostiki virusnih okužb rastlin nam je povedal Denis Kutnjak.

izjava...

Poleg uporabe v diagnostiki infekcijskih bolezni pa se metode novejše generacije sekvenciranja uporabljajo tudi v medicini, kjer vodijo v personaliziran pristop do pacienta. Ta pomeni, da posamezniku določimo tveganje, da zboli za boleznijo, ter mu glede na tveganje prilagodimo preventivne ukrepe in primerno zdravljenje. Tveganje za razvoj bolezni določajo poškodbe ali podedovane spremembe genov. Navadno so učinki sprememb v posameznih genih majhni ali celo neopazni, vendar prispevajo k skupnemu učinku, ki je tako vsota prispevkov vseh vpletenih genov.

Da zbolimo, je včasih dovolj mutacija v enem samem genu. Takšen primer bolezni je cistična fibroza, ki se izrazi pri otroku, ki prejme okvarjeni gen od obeh staršev. Zaradi mutacije gena oboli približno 1 od 5000 novorojenih, mutacijo pa nosi vsak 25. človek. Več o medicinski diagnostiki takšne bolezni nam je povedal profesor Radovan Komel.

izjava...

Nekateri ljudje so izpostavjeni večjemu tveganju za določene bolezni. Bolezni pa imajo lahko kompleksno genetsko zasnovo. To pomeni, da je za nastanek patološkega stanja potrebno, da se hkrati pojavijo mutacije v več različnih genih. Sekvenciranje predstavlja orodje za identifikacijo mutacij, njihovo poznavanje pa nas vodi do pravega načina zdravljenja. Primer takšnih bolezni so denimo rakava obolenja. Posamezniki glede na genetsko osnovo različno presnavljamo in se odzivamo na zdravila. V okviru projekta Cancer genome atlas tako poteka sekvenciranje več tisoč različnih vrst rakavih celic in bo v prihodnosti nepogrešljivo orodje za razumevanje ter zdravljenje raka.

Tveganje za nekatere bolezni se lahko določi že pred rojstvom otroka. Vse več je komercialno dostopnih prenatalnih testov, ki staršem omogočajo vpogled v zarodkovo DNK. Ti se osredotočajo na odkrivanje Downovega sindroma in drugih trisomij, kjer je namesto običajnega para kromosomov prisotna še tretja kopija. S testi se določa tudi druge pogoste kromosomske in genetske nepravilnosti. Pridobitev zarodkove DNK z amniocentezo je lahko tvegana, metode naslednje generacije sekvenciranja pa omogočajo analizo iz vzorca materine krvi, v kateri se nahajajo fragmenti DNK ploda. V Sloveniji si bodoči starši poleg presejalnih testov v nosečnosti takšno dodatno komercialno analizo lahko privoščijo za približno 600 evrov. Ker pa testi niso popolnoma zanesljivi, je potrebna potrditev z invazivno diagnostiko.

Dostopnost genetskih testov prinaša določene prednosti, vendar pa ni veliko podatkov o kratkotrajnih in dolgotrajnih posledicah, ki jih takšno testiranje lahko ima na posameznika. Pacienti bi poleg informacij o njihovem genomu morali imeti na voljo natančno interpretacijo in svetovanje, kjer bi bili opozorjeni na omejitve genetskih testov. Genetska predispozicija še ne pomeni, da se bo nek gen zares izrazil v obliki bolezni. Zato takih analiz ne moremo jemati kot popolnoma zanesljive, še posebej ker za veliko večino genov funkcije še niso dovolj jasno raziskane. Težko je napovedati, kako bo poznavanje tveganja, da zbolimo, vplivalo na kvaliteto in trajanje življenja.

Čeprav nam personalizirana medicina lahko korenito izboljša življenje, pa utegne le še poglobiti vrzel med revnimi in bogatimi. Večina svetovnega prebivalstva živi v državah v razvoju, kjer pa se za napredek v zdravstvu namenja znatno manj sredstev kot v razvitih državah. Po glasbenem premoru bomo izvedeli še, kako potekajo analize v povezavi z DNK na področju forenzike.

vmesni komad

Dobrodošli nazaj v zadnjem delu oddaje Frequenza della scienza na 89,3 MHz. Govorili smo o uporabi metod sekvenciranja v molekularni biologiji, evolucijski biologiji, metagenomiki in medicini. Sekvenciranje naslednje generacije prinaša spremembe tudi v genetskih laboratorijih, ki se ukvarjajo s sodno medicino in forenziko. Sekvenciranje omogoča preverjanje sorodstvenih odnosov in identifikacijo pogrešanih oseb ter bioloških sledi.  

V primerjavi z vzorci drugih laboratorijev se forenziki spopadajo z dokaznimi gradivi, ki vsebujejo nizko število kopij DNK. Vzorci so pogosto v procesu razkrajanja in vsebujejo številne kontaminacije, zahteve po točnosti in ponovljivosti metod pa so zelo visoke. Sekvenciranje naslednje generacije poleg identifikacijskih testov omogoča tudi izdelavo baze podatkov DNK zaporedij.

V laboratoriju za forenzično genetiko Inštituta za sodno medicino v Ljubljani in v Nacionalnem forenzičnem laboratoriju policije so nam povedali, da sekvenciranja še ne uporabljajo v svojem rutinskem delu. Genetski identifikacijski testi s preiskavo DNK sicer veljajo kot dokazno gradivo v civilnih in kazenskih postopkih. To pa je glavni razlog, da je vpeljava nove metode dolgotrajen in strogo reguliran proces.  

Ozko grlo pri vpeljavi metod naslednje generacije sekvenciranja v vsakodnevno uporabo je bioinformatika. Brez analize sekvenc podatki na trdih diskih računalnikov tako v znanosti kot v klinični medicini nimajo nikakršne uporabne vrednosti. V splošnem velja, da se za vsak porabljen evro za pridobitev sekvence porabi še dodaten evro za njegovo bioinformacijsko analizo. O vlogi bioinformatike smo povprašali doktorja Tomaža Accetta s Katedre za mikrobiologijo in mikrobno biotehnologijo Biotehniške fakultete.

izjava...

Metode naslednje generacije zahtevajo oziroma predstavljajo priložnost za multidisciplinarno sodelovanje med biologi, programerji, statistiki, zdravniki, bioinformatiki. Zagotovo v delo raziskovalcev prinašajo več sedenja za računalniki in neizogibno uporabo programskih orodij. O vsakodnevni uporabi bioinformatike nam je povedal doktor Denis Kutnjak z Nacionalnega inštituta za biologijo.

izjava..

Pomen metod sekvenciranja je odvisen od našega razumevanja, kaj določene sekvence DNK in njeni proteinski produkti delajo znotraj živih organizmov. Še vedno obstaja znatno število proteinov, katerih funkcije poznamo, a jim kljub zmogljivi tehnologiji sekvenciranja še nismo uspeli pripisati zaporedja DNK. Naše razumevanje zaporedij DNK, pridobljenih s sekvenciranjem, tako temelji na obsegu baz podatkov, ki povezujejo sekvence z določenimi organizmi ter funkcijami. O interpretaciji sekvenc je več povedal Tomaž Accetto.

izjava..

Velik napredek v metodah določanja zaporedja DNK z različno hitrostjo dosega številna področja. Sekvenciranje postaja vse bolj dostopen molekularni mikroskop, orodje, s katerim opazujemo najrazličnejše procese znotraj organizmov in širše v okolju.

Odkritja v zgodovini molekule DNK in razvoj sekvenciranja so močno vplivala na današnje razumevanje življenja. Kakšen pa bo vpliv na naša življenja v prihodnosti, bodo določale nadaljnje raziskave. Poleg določanja zaporedij DNK obstajajo tudi drugi napredni postopki za analizo in manipulacijo molekul DNK, ki smo jih nocoj izpustili. Vse to nam lahko prinese veliko dobrega - novi načini odkrivanja in zdravljenja bolezni, izboljšave na področju pridelave hrane in še boljše razumevanje narave in živih organizmov.

Trenutno na primer predstavlja sekvenciranje lastnega genoma zgolj kaprico, v prihodnosti pa bo morda vključeno v osnovne laboratorijske preiskave za spremljanje zdravja posameznika. A vendarle se je treba zavedati tudi potencialnih etičnih dilem, ki bi se lahko pojavile denimo na področju prenatalne diagnostike. Pri sprejemanju novih tehnologij moramo biti previdni in premišljeni, vseeno pa zaenkrat ostanimo optimistični.

Po dvojni vijačnici sta plezali Barbara in Katarina.

Brala sta Pia in Čeh.

Tehniciral je Lynch.

Urednikoval je Arne.

 

facebook twitter rss

Komentiraj

Plain text

  • No HTML tags allowed.
  • Spletni in e-mail naslovi bodo samodejno pretvorjeni v povezavo.
  • Samodejen prelom odstavkov in vrstic.

Z objavo komentarja potrjujete, da se strinjate s pravili komentiranja.