DNK? Milijonkrat, prosim.
V današnji oddaji Frequenza della scienza bomo spoznavali verižno reakcijo s polimerazo, veliko bolj znano s kratico PCR. Metoda je povzročila pravo revolucijo na področju molekularnobioloških raziskav, biotehnologije in medicine. Že zdavnaj je presegla okvire tistega, za kar je bila prvotno zasnovana, torej pomnožitev velikega števila kopij določenega odseka DNK.
Pravzaprav si je danes brez PCR-ja, njegovih številnih izpeljank in na PCR-ju temelječih metod težko sploh predstavljati raziskovanje na področju ved o življenju, biotehnološko proizvodnjo, diagnostiko in forenziko. Modifikacije osnovnega PCR-ja danes uporabljamo denimo za diagnosticiranje okužb ali raka, določanje nukleotidnega zaporedja genoma ene same celice, kvantifikacijo molekul DNK ali RNK v vzorcu ter identifikacijo storilcev kaznivih dejanj iz majhne količine biološkega materiala. Vendar je večina prvič slišala za PCR šele pred dvema letoma v povezavi s testi za detekcijo novega koronavirusa, o katerih bo beseda tekla proti koncu oddaje.
Za začetek obnovimo znanje o molekuli DNK. DNK je polimer, kar pomeni, da je zgrajena iz dolgega sosledja osnovnih gradnikov. Te imenujemo nukleotidi. Molekule DNK so sestavljene iz linearnih verig štirih različnih nukleotidov. DNK je v celicah organizirana v obliki dveh medsebojno povezanih dolgih verig nukleotidov, ki se ovijata okoli osi v obliki dvojne vijačnice. Verigi sta med seboj povezani kot zapeta zadrga. Lahko si predstavljamo, da so nukleotidi zobci zadrge, ki jih skupaj držijo vodikove vezi, medmolekularne vezi med nukleotidi obeh verig. Vendar lahko posamezen nukleotid tvori vez le s točno določenim nukleotidom, s katerim se strukturno ujema, kot bi šlo za dva koščka sestavljanke.
Pomembna posledica tega specifičnega povezovanja nukleotidov je, da nukleotidno zaporedje ene verige DNK določa nukleotidno zaporedje druge verige, čemur pravimo komplementarnost. Druga veriga mora namreč imeti zaporedje nukleotidov, ki je komplementarno prvi verigi, da se bosta lahko kot zadrga povezali v celoto. Tako je tudi pri sintezi DNK v celicah ena veriga matrica za sintezo druge. Podrobneje nam proces podvojevanja DNK v celicah opiše docent Matej Skočaj s Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na Biotehniški fakulteti.
Kot je omenil doktor Skočaj, sodeluje pri podvojevanju DNK veliko encimov in drugih proteinov. Encimi helikaze razklenejo verigi DNK, kot da bi odprli zadrgo. Encimi DNK polimeraze pa dodajajo nukleotide, gradnike DNK, in tako sintetizirajo nove verige DNK. Vendar DNK-polimeraza ne more začeti z dodajanjem nukleotidov kar sredi ničesar, temveč lahko le podaljšuje že obstoječe odseke nukleinskih kislin, torej molekul DNK ali RNK.
Zdaj pa se prestavimo v Kalifornijo v 80. leta prejšnjega stoletja. V laboratorijih biotehnološkega podjetja Cetus Corporation so v tistem času delali poskuse, ki so postavili temelje za razvoj metode PCR, kot jo poznamo danes.
Izumitelj PCR-ja Kary Mullis se je v podjetju zaposlil leta 1979. Njegova prvotna naloga je bila, da je kemijsko sintetiziral oligonukleotide. Ti so kratka, enoverižna zaporedja, sestavljena iz nekaj deset nukleotidov, bolj znana z angleškim izrazom primer. Primer z določenim nukleotidnim zaporedjem se prek vodikovih vezi poveže z odsekom na molekuli DNK, ki ima komplementarno zaporedje. Z njihovo pomočjo so zato lahko ugotavljali, ali je v vzorcu DNK prisotno določeno nukleotidno zaporedje. Če v vzorcu ne bi bilo komplementarnega zaporedja, do vezave ne bi prišlo. S testiranjem, ali se določen primer veže na DNK v vzorcu, so denimo lahko razlikovali med vrstami bakterij ali odkrivali mutacije v genih.
Leta 1983 pa je postopek sinteze primerjev postal avtomatiziran, tako da so v Cetus Corporation lahko sintetizirali več oligonukleotidov, kot je bilo povpraševanja po njih. Tamkajšnji znanstveniki so zato imeli proste roke, da so se v laboratoriju igračkali z njimi.
Kot pri mnogih pomembnih izumih pa se zamisel o PCR-ju Mullisu ni pojavila v laboratoriju, temveč v povsem drugačnem okolju, in sicer med nočno vožnjo sredi gora v Severni Kaliforniji, ko je lahko pustil mislim prosto pot. Med premišljevanjem o novem načinu določanja nukleotidnega zaporedja se je Mullisu porodila ideja, kako bi lahko v epruveti pomnožil želeni odsek molekule DNK. Proces je poimenoval PCR. V osnovi med PCR-jem najprej razklenemo dvojno vijačnico DNK, da dobimo dve ločeni verigi. Obe verigi pa sta matrica za izgradnjo novih odsekov molekule DNK.
PCR-reakcijo začnemo tako, da dolgi molekuli DNK iz vzorca dodamo nukleotide, encim DNK-polimerazo in dva primerja. Ključna Mullisova zamisel je bila uporaba dveh primerjev v eni reakciji: od tega mora prvi imeti takšno zaporedje, da se veže na eno verigo dolge DNK, drugi pa bi se vezal na komplementarno zaporedje na drugi verigi dolge DNK. V prvem koraku reakcije dolgo molekulo DNK s segrevanjem razklopimo na dve ločeni verigi; visoka temperatura namreč poruši vodikove vezi med nukleotidi, zaradi česar se DNK odpre kot zadrga. Nato znižamo temperaturo, da omogočimo vezavo primerjev na DNK. Prvi primer se veže na prvo verigo dolge DNK, drugi pa na drugo. V naslednjem koraku pa DNK-polimeraza dodaja nukleotide na konec vezanih primerjev po nareku nukleotidnega zaporedja komplementarne verige DNK.
Po koncu prvega cikla reakcije torej dobimo dvakrat večjo količino želenega odseka DNK. Vendar imamo v reakcijski zmesi mešanico krajših odsekov DNK, ki jih je DNK-polimeraza sintetizirala iz primerjev in se prek vodikovih vezi še vedno držijo prvotnih dolgih verig DNK. Na začetku drugega cikla moramo zato ponovno segrevati zmes, da razklopimo dolge DNK verige in kratke odseke DNK. Med drugim ciklom se primerji povežejo tako s prvotnimi dolgimi verigami DNK kot tudi s kratkimi odseki DNK, sintetiziranimi v prejšnjem koraku. DNK-polimeraza pa nato z dodajanjem nukleotidov ustvari nove kratke odseke DNK po nareku tako dolgih verig DNK kot kratkih odsekov. Na koncu tretjega cikla tako dobimo že štirikrat več kopij želenega odseka, kot smo jih imeli na začetku. Z vsakim dodatnim ciklom pa se njihovo število eksponentno poveča. Po nekaj ponovitvah reakcije tako dobimo več tisoč kopij, po nekaj deset ciklih pa več milijonov kopij.
Prvih nekaj mesecev po tem, ko se mu je porodila zamisel o PCR-ju, je Mullis porabil za načrtovanje in izvedbo prvih poskusov. Še veliko drugih znanstvenic in znanstvenikov, sprva iz Cetus Corporation, nato pa tudi od drugod, je moralo vložiti veliko dodatnega truda, da smo dobili metodo, kot jo poznamo danes. Ena pomembnih zgodnjih inovacij je bila uporaba DNK-polimeraze, izolirane iz bakterije Thermus aquaticus, ki živi v vročih termalnih vrelcih v Yellowstonu. Bakterija namreč lahko raste pri zelo visokih temperaturah, kar ji omogočajo termostabilni proteini. Ti ohranijo svojo strukturo in funkcijo celo pri temperaturah blizu vrelišča.
Izvedbo PCR-ja pa ni olajšala le termostabilna DNK-polimeraza, ampak tudi izum cikličnega termostata, naprave, ki avtomatsko spreminja temperaturo v različnih korakih reakcije PCR. Pred tem so namreč znanstvenice in znanstveniki morali epruvete, v katerih je potekala reakcija, ročno prestavljati v vodne kopeli z različno temperaturo. Znotraj vsakega cikla PCR-reakcije so morali reakcijsko zmes prestaviti v tri različne kopeli in jo v vsaki kopeli pustiti točno določen čas. Danes pa po zaslugi termostabilne DNK-polimeraze in cikličnega termostata na začetku zmešajo vse reagente za PCR, jih vstavijo v napravo, nato pa lahko za nekaj ur odkorakajo stran in počnejo kaj drugega, medtem ko se DNK pomnožuje.
Morda se zdaj sprašujete, zakaj sploh potrebujemo vso to DNK. Videti je, da v času rojstva metode PCR tudi znanstvena skupnost ni vedela, kaj bi lahko z njo počela. Snovalec ideje o PCR-ju Kary Mullis je namreč po prvih uspešnih poskusih napisal znanstveni članek in ga poskušal objaviti v prestižnih revijah Science in Nature, ker se mu je zdelo odkritje pomembno. Obe sta ga zavrnili. V nekaj letih po prvih Mullisovih poskusih pa je uporaba PCR-ja naravnost eksplodirala. Metoda se je pojavljala v vse več znanstvenih člankih. Leta 1993, le deset let po prvih poskusih, je Kary Mullis prejel Nobelovo nagrado za odkritje PCR-ja. Vendar se z današnjega zornega kota zdi, da se je na začetku devetdesetih razmah PCR-ja šele zares začel. V tistem času se je namreč rojeval kvantitativni PCR, pomembna modifikacija osnovne metode, ki jo med drugim uporabljamo za detekcijo novega koronavirusa. Oboje, torej kvantitativni PCR in teste, bomo predstavili v nadaljevanju oddaje. Ostanite z nami na 89,3 MHz.
Na frekvenci 89,3 MHz poslušate Frequenzo della scienzo, oddajo znanstvene redakcije Radia Študent, ki je na sporedu vsako drugo nedeljo ob dvanajstih. Vašo radovednost danes tešimo z milijoni kopij DNK. Na vprašanje, ali je možno prešteti vse nastale kopije DNK, delno odgovori posebna vrsta metode PCR. Ta poleg potrjevanja prisotnosti ali odsotnosti iskanega odseka omogoča tudi določanje količine DNK. Metodi pravimo PCR v realnem času, uporablja pa se tudi ime kvantitativni PCR, krajše qPCR.
Pri klasični PCR-reakciji zaznavamo produkt po končani reakciji, torej po zadnjem ciklu. S kvantitativnim PCR-jem pa lahko spremljamo nastajanje produkta že med reakcijo. Reakcijo lahko spremljamo z merjenjem fluorescentnega signala, zato moramo v reakcijo vključiti tudi fluorescentne molekule. Kako poteka kvantifikacija DNK z metodo qPCR, nam razloži raziskovalka doktorica Dunja Urbančič s Katedre za klinično biokemijo Fakultete za farmacijo.
Kot smo že slišali, se količina DNK v vsakem dodatnem ciklu PCR-ja podvoji. Zato lahko sklepamo, da je bilo več dednine v tistem vzorcu, v katerem je fluorescentni signal v manj ciklih presegel vnaprej postavljeno mejno vrednost. Število ciklov, ko fluorescentni signal doseže mejno vrednost, torej prag cikla, označimo s kratico ct, ki označuje angleški izraz cycle threshold. Prav ct pa je podatek, ki je mnogokrat podan tudi na laboratorijskih izvidih.
Kasneje je s pomnoževanjem nastalih produktov rast števila produktov iz cikla v cikel eksponentna. Vendar število nastalih produktov ne narašča v nedogled. Po določenem številu ciklov, običajno 35 do 45, novi produkti ne nastajajo več, zato ni smiselno povečevati števila ciklov v neskončnost. Vzrok za to je prebitek produktov PCR-ja, ki pri prilepljanju začetnih oligonukleotidov oziroma primerjev te izpodrinejo in se kompetitivno vežejo nazaj na drugo verigo DNK. Tako se zgodi tako imenovani efekt platoja, ko novi produkti ne nastajajo več, zato ciklov ni smiselno povečevati v neskončnost. Da bi nastalo čim več produkta, dajemo v reakcijo začetne primerje v prebitku.
Kvantitativni PCR ima številne prednosti. Metoda je občutljiva in hitra, po pripravi reakcijske zmesi pa ni treba naknadno rokovati z vzorcem, zato je možnost njegove kontaminacije majhna. Kljub objektivnosti in natančnosti je metoda tehnično dokaj zahtevna; pomembna je natančna interpretacija rezultatov. Zahtevnost tiči predvsem v teoretični zasnovi reakcije pomnoževanja. Izhodno količino dedne zasnove v vzorcu je namreč treba izračunati iz količine namnoženega majhnega delca genoma.
Kvantitativni PCR je najhitrejša in najbolj natančna metoda za določanje prisotnosti in količine virusa v biološkem vzorcu. Dednina organizmov je v obliki DNK, pri nekaterih virusih pa v obliki RNK. Ker je metoda PCR zasnovana za pomnoževanje verige DNK, je treba za dokazovanje genskega materiala organizmov z RNK najprej izgraditi DNK s procesom reverzne transkripcije. Prepis poteka tako, da encim reverzna transkriptaza na obstoječi primer dodaja posamezne nukleotide, ki so komplementarni RNK-matrici. Encim torej katalizira proces, ki poteka v nasprotni smeri kakor transkripcija, od koder izvira ime tako encima kot tudi procesa, ki ga katalizira - reverzna, torej, lahko bi rekli, obratna transkripcija. Metoda PCR z reverzno transkripcijo se tako pogosto uporablja pri preučevanju genomov virusov, kot so virus influence, HIV in navsezadnje tudi sars-cov-2. Pomen reverzne transkripcije nam na primeru virusa SARS-CoV-2 predstavi doktorica Urbančič.
Ker je osrednja tema današnje oddaje molekularnogenetska diagnostika, je treba razjasniti pojma občutljivost in specifičnost. To sta namreč osrednja parametra, ki opisujeta zanesljivost, ponovljivost in točnost kateregakoli testa.
Specifičnost diagnostičnega testa je verjetnost negativnega izida testa pri osebah, ki nimajo bolezni. Lažno pozitivne rezultate lahko v splošnem dajejo kontaminacije ali vzorcu podobne snovi, vendar pri PCR-ju le redko dobimo lažno pozitiven rezultat. Če vzamemo primer virusa SARS-CoV-2: za prepoznavo posameznega virusnega gena se morajo nanj vezati vsaj tri kratka zaporedja DNK iz testa, da se reakcija sploh začne. Ker iščemo tri regije in ne le ene, je verjetnost, da bi bil rezultat posledica naključja, še toliko manjša. Test je zato s takim pristopom bolj specifičen.
Verjetnost pozitivnega izida testa pri okuženih osebah označujemo z občutljivostjo. Prav kvantitativni PCR omogoča visoko občutljivost, saj pomnožimo začetno število kopij do količin, ki jih lahko z gotovostjo zaznamo in potrdimo njihovo prisotnost. Tako se vse metode PCR ponašajo z visoko občutljivostjo in specifičnostjo.
Pojma lahko razložimo s primerjavo antigenskih testov z metodo PCR za določanje virusa SARS-CoV-2. Za oba testa je potreben bris nosno-žrelnega predela, vendar pri hitrem antigenskem testu določamo protein, pri PCR metodi pa, kot smo že povedali, specifičen odsek virusne RNK. Hitri antigenski testi so, kot pove že ime, veliko hitrejši, vendar je zaradi te hitrosti zanesljivost manjša. Verjetnost, da tak test ne bo prepoznal prisotnosti virusa in bo torej njegov izvid lažno negativen, je precej višja kot pri metodi PCR.
Še pred glasbenim premorom pa se na hitro dotaknimo kontroverznosti okoli Karyja Mullisa, izumitelja metode PCR. Mullis je izrazil dvome o tem, da HIV povzroča AIDS, ni se strinjal z znanstvenimi dokazi, ki povezujejo človeško aktivnost s podnebnimi spremembami ter javno priznal, da verjame v astrologijo in da je v šestdesetih in sedemdesetih letih prejšnjega stoletja zaužil veliko LSD-ja. Po vsem naštetem verjetno ne moremo biti presenečeni, da so ga teoretičarke zarot in zanikovalci kovida vzeli za svojega. Na internetu kroži veliko tez, da naj bi sam Kary Mullis rekel, da PCR ni primeren za detekcijo virusov sars-cov-2.
Mullis je umrl avgusta 2019, torej za sars-cov-2 sploh ni slišal in ni mogel dajati izjav glede testov za novi koronavirus. Pač pa se zanikovalci in zanikovalke sklicujejo na njegove starejše izjave, ponavadi vzete iz konteksta, ali mu celo pripisujejo reči, ki jih ni nikoli izrekel. Kot omenjeno pa se pri testiranju na novi koronavirus ne uporablja PCR, kot ga je razvil Mullis, ampak kvantitativni PCR, pomembna modifikacija osnovne metode, s katero v medicini rutinsko diagnosticiramo več povzročiteljev bolezni.
Dobrodošli v oddaji Frequenza della scienza na valovih Radia Študent, v kateri na skoraj pomladno nedeljsko popoldne z metodo PCR potujemo po genskem zapisu. V tem delu bomo obiskali še nekaj področij, ki bi danes težko shajala brez PCR-ja.
Metoda PCR in njene različice so v medicini, biologiji in genetiki ene izmed osrednjih diagnostičnih metod. Široka aplikativnost se kaže tudi v industriji; z metodo med drugim določajo količino mikrobne obremenitve v živilih in odkrivajo gensko spremenjene organizme. Več o široki uporabi PCR-metod pove doktorica Urbančič.
PCR je dal nov zagon tudi tehnologiji rekombinantne DNK. Kaj je to, pojasni doktor Matej Skočaj z Biotehniške fakultete.
Tehnologija rekombinantne DNK torej v osnovi pomeni, da vzamemo DNK iz enega organizma in ga vstavimo v drug organizem, najpogosteje z namenom, da bi drugi organizem proizvajal določeno molekulo iz prvega organizma. Tehnologija se veliko uporablja v raziskovalne namene, pa tudi za proizvodnjo produktov za vsakodnevno življenje. Primeri so gensko spremenjeni riž, ki proizvaja vitamin A, kvasovka, ki proizvaja človeški inzulin, in gensko spremenjene bakterije, ki proizvajajo encime za pralne praške.
Kakšna pa je vloga PCR-ja pri tehnologiji rekombinantne DNK?
Tehnologija rekombinantne DNK še zdaleč ni edino področje, ki je pograbilo PCR. Kot primer uporabe kvantitativnega PCR-ja v rutinski diagnostiki lahko navedemo tudi hitro diagnosticiranje najpogostejših kromosomskih bolezni v prenatalnem obdobju, kot so Downov ali Edwardsov sindrom, pri katerih celice vsebujejo dodaten kromosom. Za analizo uporabijo genomsko DNK, ki jo izolirajo iz celic placente ali amnijske tekočine. Za določitev prisotnosti in količine dodatnih kromosomov nato v PCR zmes dodajo specifične primerje, ki se vežejo na točno določena zaporedja iskanih kromosomov.
Določanje genotipa posameznika ter spremljanje in diagnosticiranje genetskih motenj nam omogoča dejstvo, da se z nastalim PCR-produktom lahko osredotočimo na odsek DNK, ki nas zanima, in ne na celoten genom. Prav tako pa se PCR-metoda rutinsko uporablja v forenziki za identifikacijo storilcev kaznivih dejanj, saj omogoča identifikacijo DNK iz majhnih vzorcev; za pomnoževanje zadostuje že ena sama molekula DNK. Tako je z uporabo PCR-ja mogoče pridobiti DNK iz prstnega odtisa ali potrditi očetovstvo.
Za občutek, kako široko uporabne so metode PCR, pa se dotaknimo še določanja nukleotidnega zaporedja DNK oziroma sekvenciranja. Z metodo sekvenciranja, katere predstopnja je metoda PCR, so v okviru velikopoteznega projekta Človeški genom določili zaporedje celotnega človeškega genoma.
Pomnoževanje želenega odseka DNK z metodo PCR je predstopnja tem pomembnim molekularno diagnostičnim metodam, ki so prava mala revolucija na področju genetike in molekularne biologije. Pri sekvenciranju se za razliko od PCR-ja prepoznavajo vse spremembe v analiziranih regijah in ne le določene, vnaprej znane spremembe.
V zadnjem času pa se vedno bolj uporabljajo metode sekvenciranja naslednje generacije in tudi pri večini teh metod je nujna stopnja pomnoževanje s PCR-jem. Sekvenciranje naslednje generacije omogoča sočasno tarčno sekvenciranje več tisoč izbranih genov ali kar celotnega genoma posameznika. Rezultat je nukleotidno zaporedje, ki ga primerjajo z zaporedjem gena v genski banki in tako določijo mesto razlike v zaporedju. V Sloveniji se v rutinski diagnostiki metode sekvenciranja naslednje generacije uporabljajo za določanje bolezni, kot so genetsko pogojena gluhost, motnje strjevanja krvi in primarna imunska pomanjkljivost.
Metodi lahko uporabimo tudi v obratnem vrstnem redu. Da se prepričamo, ali smo s PCR-jem res namnožili odsek, ki nas zanima, lahko s sekvenciranjem določimo celotno zaporedje baz produkta PCR-ja in ugotovimo, ali zaporedje pripada iskanemu delu gena. Kvantitativni PCR uporabljamo kot zlati standard za potrjevanje sprememb v nukleotidnem zaporedju, ki jih odkrijemo z metodami sekvenciranja naslednje generacije.
S trendom miniaturizacije in testiranja na mestu oskrbe so se razvili tudi sistemi PCR, ki temeljijo na mikrofluidnih platformah. Sistemi so primerni za hitro in točno diagnosticiranje na licu mesta. To je uporabno za denimo diagnosticiranje antraksa, ki se uporablja kot biološko orožje, na poštnih postajah v ZDA, in HIV-a ali tuberkuloze v Južni Afriki, kjer je pojavnost teh povzročiteljev hudih bolezni visoka.
Dejstvo, da ima vse, kar živi na tem planetu, genom, DNK ali RNK, kaže na veliko uporabnost te izjemne molekularno diagnostične metode, ki omogoča vpogled v mikroskopski svet in nam tako pomaga najti odgovore na zastavljena vprašanja. Prav zato si znanstveniki in znanstvenice od PCR-metod obetajo še veliko več in so optimistični glede nadaljnjega razvoja metode in vseh njenih različic. Menijo, da se bo diagnostika s PCR-jem razširila tudi na primarno zdravstveno oskrbo; pričakujejo, da jo bodo izvajali v vsaki zdravniški ordinaciji in lekarni; nekega dne pa se bo test morda znašel celo v naši domači omarici za zdravila poleg termometra.
S PCR-metodo sta se kar nekajkrat pomnožili Angelika in Urška.
Brala sva Pia in Biga.
Tehniciral je Jaka.
Lektorirala je Višnja.
Dodaj komentar
Komentiraj