Če vam je kdo kdaj trdil, da pravljice že nimajo kaj iskati v znanosti, se je debelo motil. Z vsesplošnim napredkom orodij za gensko spreminjanje organizmov je to, kar se nam je nekoč zdelo fikcija, sedaj resničnost. Odpiramo veliko knjigo genetskih orodij, prisluhnili bomo zgodbi o transpozonskem sistemu poimenovanem Sleeping beauty. Transpozonsko orodje za načrtno spreminjanje dednine so raziskovalci iz dolgega, več milijonov let starega evolucijskega spanca obudili pred šestindvajsetimi leti. V nadaljevanju bomo poslušali o njegovem odkritju, nato pa razmišljali, kaj nas uči nauk te znanstvene zgodbe in kako se ta razlikuje od pripovedi ostalih genetskih orodij. Najprej pa, kaj sploh so transpozoni?

Transpozoni so skakajoči geni – angleško jumping genes  – odseki v genomu, ki lahko s časom spreminjajo svojo pozicijo. Torej se transpozirajo. Zamislimo si genom kot knjigo. Besede v njej so sestavljene iz štirih različnih črk: A, T, G in C, vsaka zastopa en nukleotid, ki gradi zaporedje DNK. Dolga zaporedja nukleotidov pišejo poglavja in ta smo poimenovali geni. V njih se skrivajo zapisi za vse, kar gradi življenje. Prestavljanje ali skakanje transpozonskih elementov po genomu si po tej analogiji predstavljamo kot, če bi se iz knjige s škarjami izrezalo nekaj poglavij, ki bi se nato nekje drugje vstavila nazaj v knjigo. Mehanizmu transpozicije, kjer se geni izrežejo ter premaknejo, pravimo cut and paste, ni pa to edin način delovanja. Škarje, ki te mehanizme omogočajo, so encimi, imenovani transpozaze.

Transpozone je v začetku petdesetih prva opisala Barbara McClintock na primeru koruze, tri desetletja kasneje pa je za svoje delo dobila Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. Sprva so transpozone obravnavali kot odvečno ali »junk« DNK. Kasneje so raziskave pokazale, da so te migrirajoči geni, ki so prisotni v genomih praktično vseh organizmov, pomembni pri celičnih procesih. Danes je znano, da transpozonski elementi nosijo zapise za razne metabolne funkcije, odpornost na različne antibiotike ter sodelujejo pri uravnavanju izražanja genov. Izkazalo pa se je, da je v genomih veliko raznovrstnih transpozonskih elementov, ki so tekom evolucije izgubili svojo zmožnost migracije po genomu.

Prav na nefunkcionalne transpozonske elemente je leta 1997 med proučevanjem dednine lososov in postrvi naletela raziskovalna skupina pod vodstvom Parrya Hacketta z Univerze v Minnesoti. Genome rib iz tamkajšnjih jezer so primerjali z genomi fosilnih ostankov rib. Z računalniško analizo so v starodavnih transpozonih določili mesta, ki so jim v preteklosti omogočala premikanje po genomu. To je pomenilo, da so se osredotočili na mesta, ki so vsebovala zapis za encim transpozazo. Ugotovili so, katere mutacije so skozi čas pripeljale do tega, da je encim izgubil sposobnost izrezovanja transpozonskih delov. S procesom obratne evolucije so čas zavrteli nazaj tako, da so v tarčno gensko zaporedje uvedli obratne mutacije. Uspelo jim je narediti funkcionalno transpozazo, ki so jo nato poimenovali Sleeping beauty, saj so jo simbolično obudili iz dolgega evolucijskega sna.

Poleg postopka obratne evolucije so raziskovalci v članku, objavljenem v reviji Cell, predstavili tudi uporabo Sleeping beauty kot prvega transpozonskega orodja za gensko spreminjanje organizmov. Deluje tako, da v celico vstavimo encim transpozazo, ki bo deloval kot škarje, ter krajšo krožno DNK, ki bo vsebovala zapis za želeno skupino genov. Sleeping beauty transpozaza bo te izrezala ter nato integrirala v dedni zapis celice. Vendar se tu pojavi bistvena omejitev orodja Sleeping beauty. Transpozaza bo želeno skupino genov integrirala na mesta v genomu celice, ki vsebujejo nukleotidno zaporedje TA. Problem nastane, saj so ta mesta v genomu prisotna praktično povsod. To pomeni, da je integracija želenih genov naključna. Če se spomnimo analogije z genomsko knjigo; tako kot bi vgrajevanje poglavij na nenačrtna mesta v knjigi prekinilo tok zgodbe, tako bi vgrajevanje tarčnega zaporedja lahko prekinilo funkcionalnost že obstoječega gena.

Poleg naključnega vstavljanja je imela prva oblika transpozaze Sleeping beauty še relativno nizko aktivnost. Priljubnost med raziskovalci ji je občutno narasla šele leta 2009, ko je svoje pravljično ime zamenjala z bolj futurističnim. Izboljšana oblika transpoznoskega sistema se je imenovala SB100x, kjer dodatek kratici poudarja stokrat večjo učinkovitost od prvotne transpozaze Sleeping beauty. Ta izboljšava je olajšala delo pri genskem spreminjanju vretenčarjev. Odmevnejši primer uporabe SB100x je bil, ko so nemški raziskovalci z omenjeno tehnologijo v oplojeno kravje jajčece vstavili več različnih genov za fluorescenco. V genom teleta so se uspešno integrirali, saj je njegova dlaka, ko so nanj posvetili z vzbujajočo svetlobo, fluorescirala v zeleni barvi. Prav tako so se mu zasvetile očesne leče, kjer so se izrazili rdeče fluorescirajoči proteini. 

Sočasno z razvojem transpozaze Sleeping beauty se je začela odvijati še ena znanstvena zgodba, ki je obetala še večje dosežke na področju genskega inženiringa. Če bi ji želeli najti pravljično ustreznico, bi lahko izbrali kar Kettejevo pravljico o Šivilji in škarjicah. Govorimo o genskih škarjah CRISPR Cas9, šivilji pa sta v tem primeru Emmanuelle Charpentier in Jennifer Doudna. Odkritje francoskih nobelovk bo letos dopolnilo deset let. Doudna sama pa je prejšnji mesec v reviji Science napovedala, da se je zgodba o CRISPR šele dobro začela. 

CRISPR/Cas9 nam napram transpozonskim sistemom omogoča natančno in načrtovano vstavljanje genov, torej na vnaprej znano mesto. Za to sta zaslužni njegovi dve komponenti, vodilna RNK ter encim Cas9. Ko se povežeta, tvorita kompleks, ki lahko zaradi vodilne RNK na verigi DNK najde izbrano mesto, Cas9 pa jo tam precepi. Tega nam transpozonski sistem Sleeping beauty ne omogoča, saj pri njem, kot smo že omenili, integracija dednine v genom poteka naključno. Vendar pa ima tudi CRISPR svoje pomanjkljivosti, saj s to metodo ne moremo vstaviti večjega števila novih genov, kot to lahko storimo z uporabo transpozonskih orodij.

Da bi zaobšli težave obeh metod za gensko spreminjanje organizmov, so se raziskovalci in raziskovalke s Paul Ehrlich inštituta pred tremi leti odločili, da orodji CRISPR/Cas9 in Sleeping beauty združijo. Vzeli so encim Cas9 in ga deaktivirali, tako da ni več mogel cepiti DNK. Nato so ga povezali s transpozazo Sleeping beauty, ki ji te lastnosti niso odvzeli. Izbrali so takšno vodilno RNK, ki je encimski hibrid vodila do mest v genomu, kjer integracija novega dednega materiala ne bi ohromila delovanja celice. Čeprav delujoča, je bila metoda sklopljena z dvema orodjema precej neučinkovita. Ista raziskovalna skupina je delo na transpozazah nadaljevala. Opisala je mutirano obliko transpozaze Sleeping beauty, ki je novo DNK vstavila v želene dele genoma sama od sebe. Spremenjena oblika encima je imela v primerjavi s prejšnjo štirideset odstotno naklonjenost do nekaterih genomskih delov, ki so jih označili za varne.

Z ali brez CRISPR se bo zgodba o transpozonskem orodju Sleeping beauty zagotovo še nadaljevala. Razvoj je trenutno najbolj usmerjen v celično terapijo CAR-T, pri kateri z genskim spreminjanjem imunskih celic dosežemo, da so te boljše v boju proti raku. Odkritelji transpozonskega sistema v člankih trdijo, da bi na področju celičnih terapij ta predstavljal alternativo virusnim vektorskim metodam, ki so sedaj v splošni uporabi. A tu ne moremo mimo dejstva, da so nekateri raziskovalci, ki so, po njihovo, Sleeping beauty obudili iz evolucijskega spanca, tudi soustanovitelji biotehnoloških podjetij, ki lastninijo tudi patente za rabo orodja. 

A kot pravi Zoltan Ivics, eden od odkriteljev Sleeping beauty, glavna omejitev orodja zaenkrat ostaja premalo usmerjena integracija DNK v genom. Pri genskem spreminjanju človeških celic si naključnosti ne moremo privoščiti. Dokler ne bo odkrite metode za bolj tarčno urejanje človeškega genoma, bo zgodba o transpozonski Trnuljčici zaenkrat ostala na laboratorijski knjižni polici.     

Pravljične prispodobe je v znanosti iskal vajenec Andraž.